인내심 있는

Jun 27, 2023

자연 미생물학 7권, 1376~1389페이지(2022)이 기사 인용

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SARS-CoV-2 Omicron 변종은 전파 수준이 매우 높으며 승인된 치료용 인간 단일클론 항체(mAb)에 의한 중화에 저항성이 있으며 백신 매개 면역에 덜 민감합니다. Omicron에 대한 추가 치료법을 제공하기 위해 우리는 이전에 감염된 백신 접종 기증자로부터 P2G3이라는 mAb를 분리하고 Omicron BA.1, BA.1.1, BA.2 및 테스트된 다른 모든 변종에 대해 피코몰 범위 중화 활성을 가지고 있음을 보여주었습니다. 우리는 P2G3 에피토프를 이전에 보고된 mAb 결합 스파이크 에피토프와 다른 클래스 3 mAb로 식별하기 위해 3.04Å 해상도의 저온 전자 현미경을 사용하여 Omicron 스파이크와 복합체를 이루는 P2G3 Fab의 구조를 해결했습니다. SARS-CoV-2 Omicron 원숭이 챌린지 모델을 사용하여 우리는 P2G3 단독으로 또는 P5C3(이전에 확인된 광범위하게 활성인 클래스 1 mAb)과 결합하여 완전한 예방 또는 치료 보호를 제공한다는 것을 보여줍니다. 시험관 내에서 P2G3 또는 P5C3에 의한 중화를 피하는 SARS-CoV-2 돌연변이를 선택할 수 있지만 감염성은 낮았고 '탈출' 돌연변이는 공개 염기서열 데이터베이스에서 극히 드뭅니다. 우리는 이러한 mAb 조합이 항오미크론 약물로서의 잠재력을 가지고 있다고 결론을 내렸습니다.

SARS-CoV-2는 전 세계적으로 3억 4천만 건 이상의 확인된 감염과 550만 건 이상의 사망자를 초래합니다1. 그 확산으로 인해 전염성이 더 강하고 면역 반응에 저항력이 있는 우려 변종(VOC)이 출현하게 되었습니다. 원래 SARS-CoV-2 균주와 비교하여 많은 수의 돌연변이를 보유한 VOC가 우세하며 Delta(B.1.617.2) 및 11~15개의 스파이크 돌연변이가 이제 감염성이 높은 Omicron 변종(B.1.1.529.1)으로 대체되었습니다. ), 스파이크 단백질에 최대 37개의 아미노산 돌연변이가 포함되어 있습니다2,3. Omicron의 스파이크 치환 중 15개는 수용체 결합 도메인(RBD)에 있습니다. 이 영역은 원래 2019-nCoV 우한 변종에 대해 모두 생성된 중화 항체(감염 또는 현재 백신에 의해 유도되었는지 여부)의 표적이 되는 영역입니다4,5,6,7 ,8. Omicron은 또한 지금까지 보고된 대부분의 항SARS-CoV-2 mAb에 의한 중화에 저항하며9,10,11,12,13,14,15 현재 BA.1.1, BA.2(B.1.1)를 포함한 여러 하위 변종으로 유통되고 있습니다. .529.2) 및 BA.3(B.1.1.529.3)2, 예방과 치료 모두에 대한 긴급한 미충족 의학적 요구를 창출합니다.

우리는 100명 이상의 기증자로 구성된 집단의 혈청 샘플에서 항스파이크 항체의 존재를 스크리닝했으며, 두 차례의 mRNA-1273 백신을 접종받았고 탁월한 범위로 가장 높은 혈청 항체 수준을 보유한 감염 후 기증자 1명에게 초점을 맞췄습니다. 삼량체 스파이크-ACE2 대리 중화 분석의 SARS-CoV-2 변종 패널에 대한 비교16. 고친화성 스파이크 결합을 위한 B 세포 클론 상청액의 스크리닝을 통해 우리는 ExpiCHO 세포에서 쌍을 이루는 중쇄 및 경쇄의 발현을 통한 mAb 생산을 위한 6개의 클론에 우선순위를 부여하게 되었습니다. 이러한 정제된 mAb의 초기 프로파일링 동안 P2G3는 원래의 2019-nCoV 스파이크 삼량체와 알파, 베타, 감마 및 델타 VOC(0.006~0.010μg/ml의 IC50)에서 발견된 돌연변이를 코딩하는 스파이크 단백질 패널에 대해 가장 강력한 결합 친화력을 나타냈습니다. ) (확장 데이터 그림 1a). 승인된 또는 임상적으로 진보된 항-SARS-CoV-2 mAb(Regeneron17의 REGN10933 및 REGN10987, AstraZeneca18의 AZD8895 및 AZD1061, Adagio19의 ADG-2, Vir/GSK20의 S309/Sotrovimab 패널을 사용하여 수행된 교차 경쟁 스파이크 RBD 결합 연구 ) 및 우리 그룹이 이전에 설명한 mAbs는 P2G3가 AZD1061 및 S309/Sotrovimab에 의해 인식되는 것과 중복되기는 하지만 고유한 에피토프와 결합한다는 것을 보여 주며, 후자는 RBD/ACE2 상호 작용을 차단하는 것과는 다른 메커니즘에 의해 작용합니다20(확장 데이터 그림 1b). 중요한 것은 당사의 강력하고 광범위하게 활동하는 클래스 1 mAb인 P5C3이 RBD를 P2G3과 비경쟁적으로 결합했기 때문에 후속 연구를 위해 이러한 mAb를 단독으로 또는 조합하여 프로파일링하게 되었다는 것입니다.

42-fold more potent than ADG-2, AZD1061, AZD8895, REGN10933 and REGN10987 mAbs and 19-fold more potent than Sotrovimab at neutralizing Omicron BA.1 spike-pseudotyped lentiviral particles (Fig. 2b). Second most potent was P5C3, with an IC80 value of 0.223 µg ml−1, and the P2G3/P5C3 combination revealed a minor-enhanced activity over P2G3 alone in this assay, with an IC80 value of 0.024 µg ml−1 for the total concentration of the two mAbs. Furthermore, P2G3 and P5C3 maintained full neutralizing activity against the ancestral D614G and Omicron BA.1.1 encoding the R346K spike pseudovirus (Extended Data Fig. 2a,b), a mutation present in ~10% of Omicron variant sequences in the GISAID11./p>10× less potent than P2G3, P5C3 and both the AZD and REGN cocktails against this virus./p>6.2 µg ml−1 at the time of viral inoculation and P2G3 treatment groups showed a significant ~4-log reduction of genomic viral RNA levels (Extended Data Fig. 4c)./p>1,200 Å2 (Fig. 5b and Extended Data Figs. 7a and 8a). To characterize the P2G3 paratope and epitope interface in detail, we performed local refinement of the P2G3 Fab-RBD interacting region and reached a resolution of 3.84 Å with well-defined density, allowing clear interpretation of sidechain positions (Extended Data Figs. 6 and 8, and Supplementary Fig. 2 and Data Table 1). The P2G3 paratope is composed of four complementarity-determining region (CDR) loops binding at the back of the RBD. The interactions are mediated through electrostatic and hydrophobic contacts (Fig. 5c,d and Extended Data Fig. 8b,c) and involve 16 residues of the RBD, mainly bound by the heavy chain of the P2G3 mAb. The 18-residue-long CDRH3 sits at the top of a loop that comprises residues 344–347, and also contacts the amino acids at the limits of the 5-stranded β-sheet (residues 440–451), overall accounting for >60% of the buried surface area (431 Å2) (Extended Data Fig. 8a–c). The interactions between P2G3 and the Omicron RBD are conserved in both RBD-up and RBD-down states (Extended Data Fig. 8c,d). CDRH2 extends the epitope by interacting with R346 that is engaged by residue W53 via a potential cation-pi interaction (Fig. 5d and Extended Data Fig. 8e), an interaction that is probably conserved with the R346K spike substitution (Extended Data Fig. 2a,b). The only potential contact from the light chain derives from the CDRL1 Y32 forming a hydrophobic interaction with V445 of the RBD (Extended Data Fig. 8c). Moreover, P2G3 is only observed to contact RBD amino acid residues and the distance to the nearest atom of the glycan branch is ~10 Å from P2G3. Importantly, the epitope defined by our structural studies rationalizes the potent neutralizing activity of P2G3 against the Omicron variant relative to other Class 3 mAbs. Omicron mutations S371L, N440K, G446S and the minor R346K sub-variant are all situated outside of, adjacent to or have little effect on recognition of the P2G3-binding epitope, whereas two or more of these mutations directly impinge on epitopes recognized by REGN10987, AZD1061 and S309/Sotrovimab (Fig. 5e). Furthermore, P2G3 displays a unique binding orientation on the RBD, with its Fab angling away from most of these Omicron mutations (Fig. 5f). In modelling the observed angles of attack of various Class 3 mAbs, it is possible that REGN10987 only binds to the up-RBD form while AZD1061 binds one up- and one down-RBD form, with steric hindrance blocking the third RBD site on the Omicron spike trimer (Extended Data Fig. 9). In contrast, P2G3 and S309/Sotrovimab probably binds both the up and down forms of Omicron RBD without clashes (Fig. 5g and Extended Data Fig. 9c), a characteristic that may contribute to the largely conserved and high potency of P2G3 across VOCs./p>

99% by SDS–PAGE analysis. Biotinylation of spike or RBD proteins was performed using EZ-Link NHS-PEG4-biotin (Life Technologies) with a 3-fold molar excess of reagent following the manufacturer’s protocol. Biotinylated proteins were buffer exchanged with PBS using an Amicon Ultra-0.5 with a 3 kDa molecular weight cut-off. Spike and RBD tetramers were prepared fresh before use and formed by combining biotinylated proteins with PE-conjugated streptavidin (BD Biosciences) at a molar ratio of 4:1./p>100 donors were monitored for levels of IgG antibody binding to the SARS-CoV-2 spike trimer proteins from 2019-nCoV, D614G, Alpha, Beta and Gamma variants in the Luminex bead-based assay./p>

1-log reduction in viral RNA and infectious virus anticipated in the lung tissue with an effective therapy that can provide statistically significant differences between treated and untreated animals. These sample size assumptions were confirmed in our statistical analysis. Statistical differences in viral RNA levels and infectivity were evaluated using the Mann-Whitney two-sided tests to compare control and treatment groups./p>

4000 cells analysed per condition. c, d) Antibody dependent cellular phagocytosis assay performed ancestral 2019-nCoV and with Omicron BA.1 variant Spike protein biotinylated and bound to streptavidin coated fluorescent beads. Beads mixed with the indicated antibody concentrations were incubated with the U937 monocyte effector cell line and antibody dependent cellular phagocytosis of the Spike coated beads was evaluated by flow cytometry. Dashed lines correspond to individual antibodies and solid lines indicate combinations of P2G3 and P5C3. Results shown are representative data for three separate experiments with each concentration response tested in duplicates or triplicates. Mean values ± SEM are shown./p>

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